Célkitűzések
Mind állati, mind heterotróf növényi sejtekben kizárólag a mitokondriális légzési elektrontranszport lánc biztosítja a sejt működéséhez szükséges energiát. A mitokondrium a növényi sejtek életében más létfontosságú, igaz kevésbé ismert szerepet is betölt, így a növényi C- vitamin (aszkorbát) bioszintézis központi szerve. Az aszkorbát (ASC) kulcsszerepet játszik a sejt fejlődésében, stressztűrő képességében. Az aszkorbinsav monodehidroaszkorbátból és dehidroaszkorbátból történő redukciója állati mitokondrium esetében már ismert folyamat. A redukcióhoz szükséges elektronok számos forrásból származhatnak: glutation, fehérje és nemfehérje eredetű tiolok, liponsav. Laborcsoportjaink már korábban leírták a dehidroaszkorbát növényi mitokondriumba történő transzportját.
Ezen ismeretek alapján a pályázat során a következő tényezőket szeretnénk megvizsgálni:
Az intracelluláris transzport szerepét az aszkorbinsav koncentráció és redox státusz alakulásában
A DHA regenerációs mechanizmusának felderítése. Az ASC regenerációt a mitokondriumban jelenlévő különféle redukálószerek végezhetik. A redox viszonyok és ezen jelöltek fogyásának részletes analízise tisztázhatja az egyes redukálószerek szerepét az ASC regenerációban
Az ASC bioszintézisének és fogyásának vizsgálata. Az ASC regeneráció fontosságának meghatározása mellett megvizsgáljuk, milyen szerepet játszik az ASC bioszintézis és fogyás az intracelluláris ASC készlet fenntartásában.
Az elsődleges anyagcsere és az ASC/DHA transzportja, bioszintézise és regenerációja közti kölcsönhatás vizsgálata
A kvantitativ adatok metabolikus modellbe történő integrálása
Eredmények
Radioaktívan jelölt ligandok rapid filtrációja során specifikus glukóz és dehidroaszkorbát transzportot figyeltünk meg, növényi mitokondriumban. A mitokondriális légzés KCN-dal törtnő gátlása és a szétkapcsolószer 2,4-dinitrofenol nem befolyásolta a vizsgált transzportfolyamatokat. Az eredmények igazolják a mitokondriális dehidroaszkorbát és glukóz transzport meglétét, valamint azt valószínűsítik, hogy azonos, mindenesetre közeli rokonságban álló transzporterek (vagy transzportrendszerek) mediálják a két transzportfolyamatot. A mitokondrium dehidroaszkorbát redukciós képessége egyértelműnek bizonyult, továbbá jelentős aszkorbát szintet tudott fenntartani. Az inkubációs közeghez adott légzési szubsztrát szukcinát fokozta az aszkorbinsav keletkezését. A komplex I szubsztrát malát, valamint a komplex I inhibitor rotenon nem befolyásolta az aszkorbát képződést. Eredményeink összeségében arra utalnak, hogy a növényi mitokondrium légzési elektron transzfer lánca - közelebbről a II-es légzési komplex - fontos szerepet játszik a dehidroaszkorbát mitokondriális redukciójában. Kísérleteink során inveráz aktivitást találtunk frissen izolált csicsóka mitokondrium mátrix alfrakciójában. Az enzimaktivitás pH optimuma, kinetikai paraméterei, valamint inhibitor profilja alapján az újonnan leírásra került enzim a neutrális invertázok családjába sorolható. Az enzimaktivitáson felül kimutattuk szubsztrátjának, valamint termékeinek mitokondriális belső membránon keresztüli transzportját.
http://nyilvanos.otka-palyazat.hu/index.php?menuid=930&num=64215